Instruções para o exame: SEQUENCIAMENTO DO EXOMA PLUS

Metodologia

A metodologia usada no exame é Sequenciamento de Segunda Geração (NGS) por Captura.

O DNA extraído é submetido a sequenciamento de segunda geração na plataforma Illumina, após enriquecimento por um método de captura. Os dados são processados para chamada de variantes (SNVs, pequenas indels) no Pipeline Genomika-Einstein. A cobertura média esperada para o DNA nuclear é de acima de 99% das bases com profundidade acima de 10x nos exons e 5pb de região intrônica adjacente, além de outras regiões não-codificantes específicas conhecidamente causadoras de fenótipos clínicos relevantes até o momento do desenho do ensaio. A numeração da variante é feita através do transcrito de referência a partir da base A do códon de iniciação ATG alinhado contra o genoma de referência GRCh37/hg19. A classificação de variantes é feita de acordo com os critérios do Colégio Americano de Genômica e Genética Clínica (ACMG).

Adicionalmente é sequenciado genoma mitocondrial com uma metodologia específica para este ensaio. Os dados são processados para chamada de variantes (SNVs, pequenas indels) no Pipeline específico para hotspot Mitocondrial da Genomika-Einstein. A cobertura média esperada para o DNA mitocondrial é de acima de 99% das bases com profundidade acima de 500x alinhado contra o genoma de referência rCRS-mito-NC-012920.

Limitações do exame

Este teste detecta >99% das variantes SNVs e de pequenas deleções e duplicações com até 20bp na análise do DNA nuclear. Variantes maiores que 20bp e menores do que um éxon podem ser detectadas com sensibilidade reduzida. Enquanto para o DNA mitocondrial, este teste detecta >99% das variantes SNVs e de pequenas deleções e duplicações com até 10bp homoplásmica e >99% das SNVs com carga mutacional superior 10% para variantes heteroplásmicas. Não são detectadas grandes deleções, duplicações e outras alterações estruturais por esta metodologia. Variantes podem não ser relatadas caso estejam presentes em regiões gênicas não sequenciadas adequadamente, regiões ricas em repetições, regiões intrônicas profundas e áreas com pseudogenes.