SEQUENCIAMENTO DOS GENES BRCA1 E BRCA2 - [706530]

A metodologia usada no exame é NGS- Sequenciamento de Segunda Geração por Multiplex.

O DNA é extraído de sangue periférico ou saliva de forma automatizada (QIASymphony). A técnica principal para o preparo da biblioteca de DNA é utilizando-se a tecnologia de PCR multiplexado com molecular barcode (QiaSeqDNA V3). Caso existam regiões não adequadamente cobertas na primeira técnica, é preparada por PCR convencional seguido de Nextera ou Sanger. O sequenciamento de segunda geração é realizado na plataforma Illumina e o sequenciamento de Sanger é realizado em um sequenciador automático ABI 3500. O resultado final é uma cobertura de 100% das bases com profundidade acima de 50x nos exons e 5pb de região intrônica adjacente. Quando variantes patogênicas são encontradas, os achados são confirmados por sequenciamento Sanger. A chamada de variante é feita através do transcrito de referência a partir da base A do códon de iniciação ATG alinhado contra o genoma de referência GRCh37/hg19. Adicionalmente é realizada a PCR seguida de eletroforese em gel de agarose do exon 3 de BRCA2 para pesquisa da inserção ALU.

• Este teste detecta pequenas deleções e duplicações até 17 bp, mas grandes deleções e duplicações não são detectadas por esta metodologia. Outras alterações estruturais,como inversões e translocações também não são detectadas. Havendo suspeita de algumas destas alterações, pode-se usar metodologias como array CGH, MLPA, qPCR ou FISH.

• Mutações por expansão de repeats de trinucleotídeos não são detectáveis por sequenciamento.

• Mutações intrônicas profundas ou em regiões regulatórias, como promotores, não são detectáveis no presente teste.

• Alteração epigenéticas não são detectáveis por este teste.